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    手动生化实验操作流程

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    一、生化实验步骤

      手动生化按试剂盒说明书进行操作,不同指标实验操作不一样,主要为抗氧化指标,包括SOD,MDA,GSH-PX,GSH,NO,NOS,CAT。

      1.样本前处理

      血清血浆:如有浑浊需3500转/分左右,离心10分钟,取上清待用。将澄清的血清血

      浆用生理盐水稀释成不同浓度进行预实验。

      组织:准确称取组织重量,按照重量(mg):体积(ul)=1:9的比例加入9倍体积生理

      水,剪碎组织,冰水浴制备匀浆,2500-3000转/分,离心10分钟,取上清即10%匀浆上清液待用。组织样本需测蛋白浓度。

      2.BCA蛋白浓度测定

      标准品配制:取1ml蛋白标准配制液加入到25mgBSA的蛋白标准管中,完全溶解蛋白标准品,即为25mg/ml蛋白标准溶液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。取适量25mg/ml蛋白标准溶液,稀释至终浓度为0.5mg/ml。标准品最好与蛋白样品用同样的溶液稀释,通常使用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

      加样:将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板中,不足20ul的加标准品稀释液补足到20ul。将待测的蛋白样品稀释至合适浓度,加入到96孔板中,使待测样品总体积也为20ul。

      BCA工作液配制:根据样本数量,按50体积BCA试剂加1体积硫酸铜溶液(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。

      反应及检测:每孔加入BCA工作液200ul,充分混匀(可将酶标板放在振荡器上振荡30s),60℃放置30min后,以标准曲线0号做参比,在562nm波长下比色测定,记录各孔吸光度值。

      计算:以标吸光值为横坐标,标准品浓度为纵坐标,绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可反算出相应的蛋白浓度,乘以样本稀释倍数即为样本实际浓度。

      3. 根据不同指标的说明书,按照操作表设置对照管测定管及空白管,加入相应的试剂及样本,反应后在指定波长下测定吸光值,根据计算公式算得样本指标含量。

    二、注意事项

    1、样本要求:样本应清澈透明,悬浮物应离心去除;避免使用溶血样本。样本收集后若不立即检测,冻存于-80°冰箱,避免反复冻融。样本每次检测使用前要混匀,用完后将相应版布局及样本编号记录在实验本上,样本及时放入冰箱。

    2、实验前准备

      核对样本个数、编号、样本量是否足够,是否有溶血的情况,核对试剂盒保质期。注意订单上备注栏客户的要求,是否做复孔等。如有问题及时与销售沟通。

    3、操作要求

      1.试剂配制要精确,点样量一定要精确,完全打尽移液枪内样本与试剂;

      2.孵育温度与时间准确;严格按照说明书上步骤操作。

      3.用多道移液器来加共同试剂或底物应用液以缩短时间,减少各孔间的误差。

      4.加样后充分混匀,保证样本与试剂的充分接触。

      5.有些指标的试剂需要-20℃保存,有的试剂在低温条件下会出现浑浊或结晶,需要37℃溶解。注意试剂盒上的标注。

      6.NOS促进剂最好现配现用,配好后尽量一日内用完,如有剩余则-20℃以下保存不超过一周;未配置前如淡黄色或白色粉末变成咖啡色或黄褐色颗粒则失效不可用。

      7.GSH-PX标准品注意要现配现用。

      8.SOD酶夏天不稳定,冬天还好一点,尽量控制实验时间在同一时间段进行。

      9.CAT实验容易产生气泡和沉淀,如产生沉淀,吸取上清后再检测,避免吸到气泡。

      10.由于微孔板在水浴锅中反应,板底会有水,所以每次检测之前都要将板底擦干再放入酶标仪中检测。水浴煮沸时小心烫伤。

      注:以上均为实验室常见指标的注意事项,如有客户自己订购的试剂盒,严格按照说明书操作。

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