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    EMSA检测

    货号:GM1010

    品牌:Servicebio

    价格:¥3000

    规格:

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    一、项目介绍

    EMSA 是一种用于研究核酸和蛋白质之间相互作用的技 术,适用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,主要是 验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性,从而间接推断已知蛋 白质的靶序列或已知序列的结合蛋白质分子。

     

    二、实验步骤

    1、 蛋白的提取

    浆蛋白核蛋白提取(细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒)

    1.1 准备溶液:室温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。

    1.2 对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。

    1.3 对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。

    1.4 对于新鲜组织:

    1.1 

    1.2 

    1.3 

    1.4 

    1.4.1 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液,并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。

    1.4.2 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置15分钟。

    1.4.3  4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)

    1.4.4 对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有破碎。

    1.4.5 

    1.4.6 

    1.4.7 

    1.4.8 

    1.4.9 

    1.4.10 

    1.4.11 

    1.4.12 

    1.4.13 

    1.4.14 

    1.4.15 

    1.4.16 

    1.4.17 

    1.4.18 

    1.4.19 

    1.4.20 

    1.4.21 

    1.4.22 

    1.4.23 

    1.4.24 

    1.4.25 

    1.4.26 

    1.4.27 

    1.4.28 

    1.4.29 

    1.4.30 

    1.4.31 

    1.4.32 

    1.4.33 

    1.4.34 

    1.4.35 

    1.4.36 

    1.4.37 

    1.4.38 

    1.4.39 

    1.4.40 

    1.4.41 

    1.4.42 

    1.4.5 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

    1.1 

    1.2 

    1.3 

    1.3.1 

    1.3.2 

    1.3.3 

    1.3.4 

    1.3 

    1.3.4 

    1.4 

    1.4.1 

    1.4.2 

    1.4.3 

    1.4.4 

    1.4.6 最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

    1.4.7 冰浴10-15分钟。

    1.4.8 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。

    1.4.9 最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

    1.4.10 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

    1.4.11  对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

    1.4.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。

    1.4.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

    1.5  每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万Hela细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)

    1.6  最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)

    1.7  冰浴10-15分钟。

    1.8  加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。

    1.9  最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。

    1.10  立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。)

    1.11  对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)

    1.12  最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。

    1.13  4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。

    1.14  立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。

    2、 制胶  (1.5mm胶,大约30分钟胶会凝)

    试剂

    浓度5.5%

    H2O         ml

    7.50

    10*TBE       ul

    500

    40%丙烯酰胺   ml

    1.50

    50%甘油      ul

    500

    10%AP       ul

    50

    TEMED        ul

    10

    总体积       ml

    10

    待胶完全凝固后120v预电泳1h,缓冲液用预冷的0.5×TBE。

    3、 蛋白与探针反应(注:蛋白浓度1 ug/uL ,上样体积2 uL)

    试剂名称

    阴性对照

    样品组

    冷竞争

    10×binding buffer

    2

    2

    2

    1ug/ul polydl.dc

    1

    1

    1

    50glycerol

    1

    1

    1

    1%NP-40

    1

    1

    1

    100m M Mgcl

    1

    1

    1

    200m M EDTA

    1

    1

    1

    Protein

    -

    +

    +

    标记探针(200 fmol

    +

    +

    +

    未标记探针(40 pmol)

    0

    0

    +

    H2O

    +

    +

    +

    总体积

    20

    20

    20

    混合后室温放置20分钟。

    4、 上样

    预电泳完后马上更换预冷的电泳缓冲液,加5ul的5×上样缓冲液到样品混合液中,马上上样电泳。180v ,60min。

    5、 电转移

    将带正电的尼龙膜放入0.5×TBE中平衡10分钟。待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转。转膜缓冲液为预冷的0.5×TBE。300m A 30分钟。

    6、 交联

    转膜完成后将膜取出,放在一张干净的滤纸上,做好标记。于紫外灯下20cm处作用20分钟。

    7、 封闭

    将交联完成的尼龙膜取出放入洗净的孵育槽,用封闭液封闭20分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇)。

    8、 抗体反应

       倒掉封闭液。用封闭液将抗体稀释300倍后,与膜完全作用30分钟。期间放于摇床上轻柔摇晃。(慢摇).

    9、 洗脱

            用1×的洗脱液清洗3次,每次5分钟。摇床速度加大。

    10、平衡

    用平衡液平衡5分钟。

    11、ECL发光检测

    12、图像分析(灰度比分析结果见EXCEl表格)

     

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